蛋白质表达、分离、纯化可以：
 

　　(1)探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；
 

　　(2)供作结构与功能的研究；
 

　　(3)作为催化剂、营养剂等。
 

　　实验步骤：
 

　　一：材料准备
 

　　1. 实验材料：大肠杆菌 BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠
 

　　2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒
 

　　二：实验操作
 

　　1. 试剂准备
 

　　2. 获得目的基因
 

　　① PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR 循环获得所需基因片段。
 

　　② 通过 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法从细胞或组织中提取总 RNA，以 mRNA 为模板，逆转录形成 cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行 PCR 循环获得产物。
 

　　3. 构建重组表达载体
 

　　① 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。
 

　　② PCR 产物双酶切后回收，在 T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
 

　　4. 获得含重组表达质粒的表达菌种
 

　　① 将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，根据重组载体的标志(抗 Amp 或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
 

　　② 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确， 进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
 

　　③ 以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。
 

　　5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
 

　　① 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中(含 100 ug/mL 氨苄青霉素)，37 ℃ 震荡培养过夜。
 

　　② 按 1∶50 或 1：100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于 100 mL(含 100 ug/mL 氨苄青霉素)LB 液体培养基中，37℃ 震荡培养至 OD600 = 0.6 - 0.8(最好 0.6，大约需 3 h)。取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　③ 对照组不加诱导剂，实验组加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l，37℃ 继续培养 1-3 h。
 

　　④ 12 000 rpm 离心 10 min，弃上清，菌体沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。
 

　　6. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
 

　　① NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入 1 mL NTA 介质，并分别用 8 mL 去离子水，8 mL 上样缓冲液洗涤。
 

　　② 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入 5 mL 上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品 60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取 10 ul 上清样品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　③ 上清样品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　④ 洗脱杂蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脱液，约 3-4 h，取 10 ul 洗脱开始时的样品用于 SDS-PAGE 分析。
 

　　⑤ 洗脱目标蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 级分，分别取 10 ul 样品用于 SDS-PAGE 分析。